Figura 1. Oociti maturati prima (A) e dopo (B) esposizione a soluzioni di CPAs precedente all’immersione in azoto liquido.

Oociti della stessa specie mostrano differenze individuali nelle loro proprietà di permeabilità alle soluzioni di CPAs, come spermatozoi prelevati da differenti maschi della stessa specie possono mostrare significative differenze nella risposta alle procedure di crioconservazione. Van der Abbeel (61) ha messo in evidenza significative differenze nelle proprietà osmotiche di oociti derivanti dallo stesso donatore. Le membrane citoplasmatiche sono danneggiate dalla riduzione della temperatura dovuta alla transizione di fase del doppio strato lipidico che altera la struttura e la funzione della membrana plasmatica (67). I dati ottenuti in numerosi esperimenti mostrano che la sensibilità di oociti di mammifero alle alterazioni indotte dalle procedure di vitrificazione differisce tra le specie. Per l’elevato livello di lipidi gli oociti di suino, ovino e bovino sono particolarmente sensibili al raffreddamento mentre gli oociti umani e murini possono tollerare meglio queste alterazioni. Sono state descritte differenze nel numero e nella struttura di vescicole lipidiche tra oociti di bovino e di suino (17). Gli oociti di suino contengono oltre due volte (161 μg) di lipidi totali rispetto all’ovino (89 μg) e tre volte rispetto al bovino (63 μg), (17, 36). Per questa ragione gli oociti di bovino e ovino sono considerati maggiormente resistenti alla crioconservazione rispetto a quelli di suino. Nella ricerca tendente a ridurre il contenuto totale di lipidi sono stati sperimentati metodi di delipidazione meccanica o chimica basati sulla centrifugazione (51) o sull’utilizzo di agenti lipolitici quali la forscolina (37). Inoltre si è cercato di modificare la costituzione dei lipidi di membrana per incrementare il rapporto tra acidi grassi insaturi e saturi nelle membrane (46, 67) mediante l’utilizzo di liposomi o la pianificazione della dieta. In proposito è stato osservato che elevate concentrazioni di acidi grassi insaturi derivati da olio di pesce hanno permesso di aumentare la criotolleranza di oociti di ovino (66).

Il fattore principale che influenza la probabilità di successo della vitrificazione è l’aumento delle velocità di raffreddamento e ripristino della temperatura. E’ stato suggerito che le procedure di vitrificazione possono essere migliorate decrementando il volume del liquido in cui devono essere contenuti gli oociti da crioconservare a meno di 1 μl. Numerosi sistemi di supporto (Cryodevices) sono stati studiati per utilizzare il minimo volume delle soluzioni di vitrificazione, tra i quali le Open Pulled Straws (OPS), cryotop (CT), cryoloop CL), superficie solida di vitrificazione (SSV). Analisi comparative tra CPAs condotte in numerosi laboratori hanno permesso di stabilire che il sistema CT sembrerebbe offrire maggiori potenzialità nel preservare la sopravvivenza dell’oocita e nell’aumentare le percentuali di fertilizzazione e di sviluppo rispetto ad altri cryodevices (31). Un ipotetico rischio di trasmissione di malattie si potrebbe ipotizzare specialmente quando gli oociti sono caricati in sistemi aperti e messi direttamente a contatto con azoto liquido contaminato (6). Di recente, questo inconveniente può essere evitato sterilizzando l’azoto liquido con radiazioni ultraviolette a 253.7 nm (45).

Il ripristino della temperatura

Recentemente numerose ricerche hanno focalizzato i loro studi anche sugli effetti della fase di ripristino della temperatura sulla sopravvivenza di oociti vitrificati. Fortunatamente, i supporti utilizzati oltre che permettere gradienti di raffreddamento molto elevati producono anche gradienti di ripresa della temperatura altrettanto rapidi. Un rapido ripristino della temperatura è essenziale per minimizzare sia la formazione di cristalli di ghiaccio durante i processi di de-vitrificazione sia la loro crescita per processi di ricristallizzazione (49). Per il ripristino della temperatura il campione è direttamente trasferito dall’azoto liquido in una soluzione ipertonica (0.5M) a 37°C contenente macromolecole non permeabili e in successivi passaggi seriali a concentrazioni decrescenti allo scopo di mantenere l’equilibrio tra l’ambiente intra ed extracellulare. Questo processo è essenziale per permettere la rimozione lenta dei CPAs dall’oocita. Solitamente le macromolecole non permeabili utilizzate sono zuccheri come il saccarosio, il trealosio e il raffinosio. La presenza di questi disaccaridi all’interno e all’esterno del citoplasma migliora le capacità di sviluppo di oociti crioconservati (11) e permette la riduzione delle concentrazioni di CPAs nelle soluzioni di crioconservazione (12). È stato evidenziato che la presenza di trealosio nel medium di maturazione in vitro stabilizza le membrane cellulari durante la vitrificazione e il ripristino della temperatura, incrementando la criotolleranza e la successiva capacità di sviluppo di oociti di suino (30) e di ovino (5).

Aspetti morfologici e molecolari

Numerosi studi hanno dimostrato che immediatamente dopo il ripristino della temperatura e durante la successiva fase di coltura in vitro gli oociti e gli embroni vitrificati richiedono un breve periodo di tempo per completare il recupero della loro attività metabolica (28). Durante questo tempo vengono riparate e rese funzionali le strutture e le molecole, che hanno subito danneggiamenti reversibili dopo la crioconservazione

Danneggiamenti morfologici

Oociti vitrificati analizzati immediatamente dopo il ripristino della temperatura mostrano severe alterazioni delle componenti strutturali citoplasmatiche. Il principale bersaglio dell’insulto da abbassamento di temperatura e osmotico è la membrana plasmatica. L’oocita, esposto a soluzioni di vitrificazione iperosmotiche durante la fase di disidratazione, non riesce a mantenere la sua forma e può verificarsi la rottura della membrana plasmatica. Inoltre una delle maggiori alterazioni durante le procedure di vitrificazione è una anomala configurazione del fuso meiotico, causata dalla disorganizzazione e disassemblamento dei microtubuli, descritta in oociti di suino (48), bovino (40), ovino (55) e equino (18, 57). I cromosomi materni durante la metafase II sono allineati da una rete di microtubuli che formano un fuso meiotico funzionale che, durante la fertilizzazione determina la segregazione fisica dei cromosomi e completa il processo meiotico con l’espulsione del secondo globulo polare. L’integrità del fuso meiotico è inoltre necessaria per attivare la degradazione del Maturation Promoting Factor (MPF) alla fertilizzazione.

La stabilizzazione del citoscheletro durante la vitrificazione potrebbe apportare miglioramenti alla sopravvivenza e al successivo sviluppo di oociti crioconservati. La citocalasina B è una molecola che ha la capacità di stabilizzare il citoscheletro rendendolo meno rigido. L’aggiunta di citocalasina B durante la vitrificazione può ridurre il danneggiamento dei microtubuli, aumentare la stabilizzazione del fuso degli oociti maturi e conservare la funzionalità delle gap junctions tra oocita e cellule del cumulo negli oociti immaturi. Risultati positivi sono stati riportati con l’aggiunta di citocalasina alle soluzioni di vitrificazione nel suino (18) e nell’ovino (50). Anche una molecola antitumorale, il taxol, è stata utilizzata come agente stabilizzante del citoscheletro durante le procedure di vitrificazione. L’aggiunta di 1 μl di taxol alle soluzioni di vitrificazione incrementa la capacità di sviluppo di oociti in specie domestiche (41), nella specie umana (14) e murina (44). Comunque opposti risultati sono stati osservati per quanto riguarda la capacità di sviluppo di oociti vitrificati di suino (15), suggerendo che sono necessari ulteriori studi. Una alternativa al loro utilizzo è quella di crioconservare oociti allo stadi di GV in cui si ha una minore sensibilità dei microtubuli citoscheletrici alla temperatura e non è presente il fuso meiotico. Nonostante queste peculiarità sono stati comunque osservati altri tipi di alterazioni quali la frattura della zona pellucida adiacente alle cellule del cumulo, la rottura delle gap junctions e/o la perdita delle comunicazioni tra comparto somatico e germinale e l’inibizione della polimerizzazione della F-actina con conseguente diminuzione delle percentuali di maturazione in oociti vitrificati di suino (18), gatto (32), bovino (48) e ovino (7). Parallelamente è stato dimostrato in oociti equini immaturi che le procedure di vitrificazione diminuivano le comunicazioni tra cellule del cumulo e oocita con un conseguente abbassamento delle percentuali di maturazione. D’altra parte una pur elevata percentuale di cellule del cumulo ooforo apoptotiche non altera le percentuali di maturazione in vitro post vitrificazione (57).

Figura 2. Alterazione del fuso meiotico di oociti crioconservati visualizzati al microscopio a epifluorescenza. A: fuso normale allo stadio di MII (verde) con cromosomi condensati (blu) allineati sul piano equatoriale della struttura; (B) fuso ridotto ; (C) fuso assente; (D) fuso asimmetrico.

La vitrificazione induce profonde modificazioni ultrastrutturali nei mitocondri di oociti di bovino che possono determinare una riduzione della vitalità (47). La funzione primaria dei mitocondri è di generare l’energia richiesta nelle fasi cruciali della ripresa dell’attività metabolica durante la fase di ripristino della temperatura. Nel suino i processi di vitrificazione e ripristino della temperatura causano una anomala distribuzione dei mitocondri (13), rispetto alla dispersione omogenea che si ha prima della fertilizzazione. Nel suino è stata osservata una riduzione del numero dei mitocondri pari al 52% rispetto a oociti non vitrificati (58). Il movimento dei mitocondri nel citoplasma dell’oocita è mediato da una rete di microtubuli citoscheletrici. Le alterazioni dei microtubuli durante la vitrificazione potrebbero influenzare il movimento dei mitocondri alterandone la distribuzione citoplasmatica. I mitocondri di oociti maturi vitrificati di bovino (47) e suino (13) si presentano allungati, con la superficie rugosa, indistinta e rotta, mentre in oociti di equino vitrificati allo stadio di GV i mitocondri si presentano rigonfi (18). Il pretrattamento con Taxol può ripristinare la normale distribuzione mitocondriale in oociti vitrificati di suino (13).

Sfortunatamente la maggior parte degli oociti vitrificati mostra alterazioni irreversibili con aspetti tipici di processi apoptotici. È stato osservato che gli oociti di bovino vitrificati in OPS hanno evidenziato processi di degenerazione durante la coltura post-vitrificazione come attivazione anomala delle caspasi e frammentazione del DNA (38). Queste alterazioni non sono state confermate da altri ricercatori che invece hanno evidenziato frammentazione del DNA solamente durante il congelamento classico ma non durante la vitrificazione (53).

Alterazioni funzionali.

Il mantenimento di un efficiente status ossido riduttivo è cruciale per la sopravvivenza dell’oocita crioconservato. Recentemente è stato rivelato che dopo le fasi di vitrificazione e ripristino della temperatura di oociti maturi di suino i livelli di glutatione (GSH) si riducono e aumentano le concentrazioni di H₂O₂ rispetto a oociti non vitrificati (52). Il GSH è noto avere un ruolo cruciale nel sistema di difesa antiossidante delle cellule ed una efficiente azione di neutralizzazione dei ROS. La presenza di antiossidanti nelle soluzioni di vitrificazione incrementano le percentuali di sopravvivenza di gameti ed embrioni vitrificati. Nostre esperienze, condotte su oociti di ovino vitrificati allo stadio di MII, hanno permesso di stabilire che i livelli del MPF risultavano significativamente inferiori rispetto agli oociti non vitrificati; mentre il livello delle MAPK non ha mostrato alcuna variazione (55). Al contrario livelli significativamente inferiori di MPF e MAPK sono stati evidenziati in oociti di ovino vitrificato allo stadio di GV (7). Ciò lascia intendere che la sensibilità alle procedure di vitrificazione dell’oocita allo stadio di GV risulta essere maggiore rispetto alla MII.

Figura 3. Attività dell’MPF misurata come intensità relative delle bande elettroforetiche ottenute dopo kinase assay sull’Istone H1 in oociti non vitrificati (A) subito dopo la vitrificazione (B) e dopo due ore di coltura in vitro dal ripristino della temperatura.

Allo scopo di valutare l’influenza della crioconservazione sul pattern di RNA messaggeri presenti nell’oocita abbiamo proceduto ad effettuare una analisi quantitativa dell’espressione di un pannello di geni (54). I geni studiati erano coinvolti in vari aspetti della biologia dell’oocita e dell’embrione preimpianto, quali il metabolismo (Na⁺K⁺ATPase), la compattazione e la cavitazione (E-Cad), la regolazione del ciclo cellulare (cyclin B and p34^cdc2), la risposta agli stress (HSP90β) e alcune delle funzioni costitutive della cellula embrionale (H2A.Z, PAP, ubiquitin, β-actin). I risultati hanno mostrato una minore quantità di alcuni dei geni analizzati negli oociti vitrificati rispetto al controllo (Fig. 3), suggerendo una generale diminuzione del contenuto degli RNA causato dalle procedure di vitrificazione. Queste generale deficienza potrebbe influenzare vari meccanismi molecolari ed essere parzialmente responsabile della bassa capacità di sviluppo del gamete femminile crioconservato (54).

Figura 4. Espressione relative degli mRNA per PAP, Na/K ATPase, E-Caderina, Ciclina B, P34cdc2, HSP90, B-Actina e Istone H2AZ in oociti controllo e vitrificati ottenuta mediante real time PCR.

I mitocondri oltre che avere un ruolo guida nella produzione di ATP sono implicati anche nella omeostasi del calcio intracellulare. Il calcio è un segnale intracellulare deputato al controllo di svariati processi metabolici della cellula. L’assenza di fluttuazioni citoplasmatiche di questo elemento e il suo mantenimento a livelli elevati potrebbe compromettere alcune funzioni della cellula. È stato descritto che sia l’incremento delle concentrazione di calcio che il rilascio del citocromo C dalle membrane mitocondriali nel citoplasma sono coinvolti nella modulazione di fattori cellulari preapoptotici che attivano le caspasi. Inoltre le oscillazioni delle concentrazione del calcio sono coinvolte nella regolazione dell’MPF mediante degradazione della ciclina B1 e nella ripresa del ciclo meiotico negli oociti maturi (35), nel reclutamento di mRNA materni e nella regolazione dell’espressione genica globale nelle blastocisti (43).

È stato osservato che con l’esposizione di oociti ad un abbassamento termico di 14 °C (33) si registra un incremento dei livelli intracitoplasmatici di calcio. Allo stesso modo l’esposizione degli oociti a soluzioni di CPAs determina un transiente incremento delle concentrazioni di calcio intracellulare. È stato osservato inoltre in oociti murini che la presenza di PROH e EG nelle soluzioni di vitrificazione aumentano le concentrazioni intracellulari di calcio agendo sui flussi dall’ambiente extracellulare; il DMSO influenza le riserve intracellulari di calcio agendo direttamente sui mitocondri e sul reticolo endoplasmatico (23), suggerendo che il DMSO potrebbe essere il CPA meno adatto per la vitrificazione dell’oocita. Pertanto l’incremento delle concentrazioni di calcio intracitoplasmatico che si registrano nell’oocita durante la vitrificazione è probabilmente dovuto a un effetto cumulativo sia dei CPAs che dell’abbassamento della temperatura. Il blocco dei flussi di calcio attraverso la membrana plasmatica attuato mediante la rimozione del calcio dalle soluzioni di vitrificazione e il contemporaneo blocco del rilascio dalle riserve intracellulari mediante l’utilizzo di agenti chelanti migliora la vitalità di oociti esposti a soluzioni di vitrificazione e incrementa la capacità di sviluppo di oociti (24, 29). L’aumento delle concentrazioni di calcio intracellulare dopo esposizione ai CPAs potrebbe mimare il processo partenogenetico come mostrato in oociti maturi di ovino (58) e di suino (52). Da nostri dati non ancora pubblicati si può mettere in evidenza che la riduzione delle concentrazioni di calcio nelle soluzioni di vitrificazione determina una riduzione delle percentuali di attivazione partenogenetica spontanea.

Ca++ nel medium di vitrificazione	N° oociti	Attivazione partenogenetica
99 mg/l	80	33(41.2%)a
67 mg/l	66	21(31.8%)ac
76 mg/l	62	15 (24.2%)bc
0.9 mg/l	80	11 (12.5%)bf
1.1 mg/l	74	6 (8.1%)def

Tabella 2. Influenza delle concentrazioni di Ca⁺⁺ nelle soluzioni di vitrificazione sulla attivazione partenogenetica spontanea di oociti di ovino maturati in vitro.

Strategie per il miglioramento della capacità di sviluppo di oociti vitrificati

L’effetto cumulativo delle alterazioni strutturali e funzionali potrebbe essere responsabile delle ridotte percentuali di divisione embrionale e del limitato numero di blastocisti derivate da oociti vitrificati. I risultati sono molto differenti tra le varie specie di mammifero, in funzione della sensibilità alle procedure di crioconservazione e alla scarsa efficienza delle tecnologie di produzione embrionale in vitro nel supportare con efficacia lo sviluppo di oociti vitrificati. In particolare nelle specie equine e canine il successo della crioconservazione dell’oocita rimane bassa se comparato ad altre specie come quella bovina e umana. Risultati deludenti sono stati ottenuti anche vitrificando oociti di suino (15) o ovino (7) allo stadio di GV o quelli derivati da animali prepuberi (56). Una strategia vincente potrebbe essere quella di trasferire gli oociti vitrificati, dopo il ripristino della temperatura nell’ovidotto di animali riceventi senza ricorrere alla coltura in vitro, come suggerito da Lazzari e coll. (25).

	oociti fertilizzati	divisi (%)			blastocisti (%)
		26°h	32°h	totale	6 gpf*	7 gpf*	8 gpf*	totale
controllo	140	63 (60.0)a	42 (40.0)a	105 (75.0)	27 (47.4)	21 (36.8)	9 (15.8)	57 (54.3)a
vitrificati	113	13 (27.6)b	34 (72.3)b	47 (41.6)	0	6 (75)	2 (25)	8 (17.2)b

Tabella 3. Tempi di divisione embrionale e capacità di sviluppo di embrioni derivati da oociti di ovino maturati in vitro e vitrificati. ^* Giorni post-fertilizatione.

Gli embrioni derivati da oociti vitrificati sono di una bassissima qualità come dimostrato dal ridotto numero cellulare, dalla ridotta capacità di impiantarsi e dare origine a gravidanze dopo trasferimento in riceventi se paragonate alle performances dei corrispondenti embrioni derivati da oociti non crioconservati (3, 39, 62). Il primo indicatore della scarsa qualità embrionale potrebbe essere la lunghezza maggiore dei primi cicli mitotici e il conseguente ritardo nella prima divisione embrionale e della formazione della blastocisti, come già osservato nell’ovino (tabella 3).Sicuramente la scarsa qualità delle blastocisti derivate da oociti vitrificati ha conseguenze dirette sulle percentuali di gravidanza e sulla vitalità neonatale, come riportato nelle specie bovina (63), umana (21), equina (34) e murina (3).

Figura 5. Vitalità e percentuali di gravidanza di blastocisti crioconservate derivate da oociti di ovino maturati in vitro freschi e vitrificati.

É stato suggerito che una temporanea esposizione a stress quale per esempio il pretrattamento con elevate concentrazioni di NaCl incrementa la criotolleranza e la capacità di sviluppo come dimostrato per oociti di suino (30). Il miglioramento della criotolleranza e la capacità di sviluppo di oocito dopo uno stress temporaneo potrebbe essere mediato da meccanismi che coinvolgono le heat shock proteins (HSPs). Stress ambientali potrebbero evocare la produzione di HSPs, le proteine maggiormente conservate coinvolte nel recupero delle strutture cellulari danneggiate. In un precedente studio abbiamo osservato un incremento della sintesi di HSPs negli embrioni di ovino in seguito a stress termici (29). Più recentemente è stato suggerito un ulteriore approccio che prevede il miglioramento delle procedure di vitrificazione mediante il pretrattamento degli embrioni con elevate pressioni idrostatiche (HHP). L’utilizzo del pretrattamento con HHP su oociti di suino incrementa la capacità di sviluppo di oociti vitrificati probabilmente mediante una stabilizzazione post trascrizionale degli mRNA per HSP70 (9).

Conclusioni

La crioconservazione dell’oocita è ancora da considerare una procedura sperimentale. La mancanza di opportunità per il transfer diretto di oociti vitrificati in riceventi sincrone limita la diffusione di questa metodologia. Un protocollo che permetta la diretta applicazione sul campo non è stato ancora sperimentato poiché si ha la necessità di rimuovere i CPAs dall’oocita prima del trasferimento.

I risultati ottenuti con differenti procedure confermano che la crioconservazione dell’oocita non è solamente un metodo semplice per aumentare la sopravvivenza e la capacità di sviluppo ma è una metodica maggiormente complessa. Un appropriato equilibrio tra tutti i fattori implicati quali la qualità dell’oocita, i CPAs permeabili e non permeabili, i supporti di crioconservazione, i volumi di vitrificazione, è necessario per minimizzare i danni strutturali e funzionali e per preservare maggiormente le potenziali capacità di sviluppo di oociti vitrificati, fino a stadi preimpianto.

Il modo migliore per aggiungere o rimuovere i crioprotettori dagli oociti e l’ottimizzzazione delle velocità di raffreddamento e di ripristino delle temperature fisiologiche possono essere dedotti da studi teorici fisico chimici. Questo è necessario per implementare la conoscenza sulle procedure di vitrificazione dell’oocita , che spesso deriva da sperimentazione empiriche, con una conoscenza dei processi di criobiologia di base molto scarsa. In questa direzione le piattaforme di trascrittomica, proteomica e metabolomica sono le tecnologie che potranno permettere di delucidare maggiormente questi processi complessi durante le procedure di crioconservazione (Supporto finanziario Regione Sardegna: progetto P5A, Centro di Competenza per la Biodiversità Animale)

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Dipartimento di Biologia Animale¹, Dipartimento di Scienze Fisiologiche Biochimiche e Cellulari², Dipartimento di Patologia e Clinica veterinaria³, Centro di Competenza per la Biodiversità Animale, Università degli Studi di Sassari.